제조사 응용 조건 그대로 넣었는데 분리가 안 돼요

조건을 다 맞췄는데도 다르다면, 종이에 안 적히는 변수를 의심해야 합니다. 그중 가장 자주 걸리는 게 펌프의 용매 혼합 방식입니다.

HPLC 그라디언트 펌프는 크게 두 가지입니다.

고압 혼합(Binary) 은 용매마다 펌프가 따로 있어서, 각각 정밀하게 밀어낸 다음 합칩니다. 혼합 정확도가 높고 dwell volume(혼합 지점부터 컬럼 입구까지의 부피)이 작습니다. 설정한 조성과 기울기가 거의 그대로 컬럼에 전달됩니다.

저압 혼합(Quaternary) 은 비율 조절 밸브가 여러 용매를 시간으로 쪼개 받아들이고, 그걸 펌프 하나가 섞어서 보냅니다. 구조상 dwell volume이 커집니다.

이 차이가 결과에 미치는 영향이 생각보다 큽니다. dwell volume이 크면 설정한 조성이 컬럼에 실제로 도달하기까지 지연이 생기고, 기울기도 체감상 더 완만해집니다. 그러면 서로 가까이 나오는 피크들이 충분히 벌어지지 못하고 붙어 보입니다. 앞서 다른 글에 있던 인젝션 직후 베이스라인 꺼짐도 같은 이유로 더 커질 수 있습니다.

즉 같은 조건표라도 고압 혼합에서는 "적힌 대로", 저압 혼합에서는 "완만하고 지연된 기울기"로 나타납니다. 응용자료는 대개 고압 혼합 기준으로 검증되니, 저압 혼합 장비에서 그대로 쓰면 차이가 납니다.

대응 방법입니다.

• 초기 유지 시간을 조정하세요. dwell volume만큼 앞에서 지연되므로, 초기 조성 유지 구간을 줄이거나 없애 보면 자료와 비슷해지는 경우가 많습니다.
• 기울기를 조금 더 가파르게 잡아 체감 기울기를 맞춥니다.
• 주입 시점을 늦추는 기능(delayed injection)이 있는 장비라면 그것으로 보정할 수 있습니다.

먼저 본인 장비의 dwell volume을 한 번 측정해두시면 두고두고 씁니다. 컬럼 대신 유니온으로 연결하고 B용매에 미량의 UV 흡수 물질(아세톤 등)을 넣어 계단식 그라디언트를 걸면, 신호가 올라오기까지의 시간에 유속을 곱해 구할 수 있습니다.